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Derivación y cultivo de células madre embrionarias en diferentes especies

Las células madre embrionarias fueron aisladas por primera vez desde la masa celular interna de blastocistos de ratón en 1981 (Evans y Kaufman 1981, Martin 1981). Estos estudios preliminares fueron la base para que años más tarde se hayan logrado establecer líneas de células madre embrionarias a partir de otras especies como el hámster (Doetschman y col 1988), cerdo (Evans y col 1990, Vackoba y col 2007), bisonte (Sukoyan y col 1993), macaco de la India (Thomson y col 1995), marmota (Thomson y col 1996), pollo (Pain y col 1996), bovino (Stice y col 1996, Cibelli y col 1998, Wang y col 2005), humano (Thomson y col 1998), perro (Hayes y col 2008) y gato (Yu y col 2008). Más recientemente, en pocas especies se han aislado líneas de células madre embrionarias a partir de embriones clonados, generados por fecundación in vitro y/o partenogénesis (Wakayama y col 2001, Cibelli y col 2002, Wang y col 2005, Byrne y col 2007, Mai y col 2007).

En un principio, las células madre embrionarias de ratón fueron derivadas y mantenidas en cocultivo con células embrionarias de la misma especie denominadas células alimentadoras, las cuales aportaban los factores de crecimiento necesarios para que estas células crezcan adecuadamente, mantengan un cariotipo normal y preserven su capacidad de autorrenovación y pluripotencia (Evans y Kaufman 1981, Martin 1981). Estudios posteriores identificaron una citoquina derivada de estas células, el factor inhibidor de la leucemia (LIF, del inglés Leukemia Inhibiting Factor), como una de las moléculas claves en prevenir su diferenciación y en mantener su capacidad de autorrenovación (Smith y col 1988, Niwa y col 1998, Matsuda y col 1999). Este factor es producido por células de diferentes especies incluyendo líneas celulares de fibroblastos de ratón (STO Mouse Fibroblast Cell Line), células de hígado de ratas búfalo (BRL, del inglés Buffalo Rat Liver), células Vero y fibroblastos embrionarios humanos (Smith y col 1988, Pease y col 1990, Talbot y col 1995). De esta forma, para el cultivo de las células madre embrionarias de ratón se puede utilizar LIF producido por las células STO, al igual que medio condicionado BRL combinado con células alimentadoras y/o medios libre de células empleando LIF recombinante en combinación con suero bovino fetal (Smith y col 1988, Williams y col 1988).

En el humano, recientemente se han derivado células madre embrionarias, células embrionarias de carcinoma y células embrionarias germinales. Sin embargo, sólo las células madre embrionarias derivadas de embriones producidos por fecundación in vitro parecieran mantener la mayoría de las propiedades pluripotenciales establecidas para las células madre embrionarias de ratón (Thomson y col 1998, Reubinoff y col 2000). Estas células humanas son denominadas comúnmente células madre embrionarias humanas, aunque por razones éticas su capacidad para reingresar a la embriogénesis y/o colonizar la línea germinal no ha sido probada, por lo que en rigor se las debería denominar “células humanas parecidas a las células madre embrionarias” (hES like cells). Si bien las condiciones de cultivo para estas células no están bien definidas como para las células madre embrionarias de ratón, los protocolos de cultivo desarrollados en los últimos años han permitido mantener poblaciones o líneas de estas células en cultivo por períodos prolongados, conservando un cariotipo normal y sus características incluyendo su potencial de diferenciación in vitro e in vivo. Así, actualmente estas células pueden crecer sobre células alimentadoras con medio libre de suero y suplementado con bFGF (del inglés basic Fibroblast Growth Factor), también sobre placas revestidas con laminina y medio condicionado por fibroblastos embrionarios de ratón o con medio conteniendo LIF recombinante en la presencia de BMP4 (del inglés Bone Morphogenic Protein 4), la cual permite sustituir los requerimientos de suero bovino fetal (Thomson y col 1998, Amit y col 2000, Xu y col 2001, Ying y col 2003).

En el caso de animales domésticos como el bovino, para el aislamiento y cultivo de las células madre embrionarias bovinas, se han utilizado diferentes tipos celulares

como sustrato, incluyendo fibroblastos fetales bovinos (First y col 1994), células epiteliales de útero bovino (van Stekelenburg-Hamers y col 1995), células STO (Talbot y col 1995), fibroblastos epiteliales de ratón (Cibelli y col 1998, Mitalipova y col 2001) y fibroblastos humanos de pulmón (Iwasaki y col 2000). Sin embargo, a pesar de haberse generado hasta la fecha al menos seis líneas de células madre embrionarias en esta especie que exhiben pluripotencia tanto in vitro como in vivo, todas varían entre sí en morfología y en marcadores genéticos de expresión normalmente asociados a estados de indiferenciación y pluripotencia de estas células en otras especies (Stice y col 1996, Cibelli y col 1998, Kitiyanant y col 2000, Mitalipova y col 2001, Saito y col 2003, Wang y col 2005). Más aún, a pesar de haberse generado quimeras transgénicas, luego de la inyección de estas células modificadas genéticamente en embriones en desarrollo, no se ha demostrado la contribución de estas células a la línea germinal y por lo tanto su transmisión a la descendencia (Niemann y Reichelt 1993, Cibelli y col 1998, Iwasaki y col 2000, Wang y Zhou 2003).

Propagación de las células madre embrionarias in vitro

En general, las células madre embrionarias se propagan por disociación enzimática de las colonias y sembrando células individuales para la formación de nuevas colonias (Evans y Kaufman 1981, Thomson y col 1995, 1996, Cibelli y col 2002). En el bovino, a diferencia de otras especies, las células madre embrionarias no forman colonias después de la disociación enzimática y posterior resembrado (Stice y col 1996, Cibelli y col 1998, Mitalipova y col 2001). Además, estas células son sensibles a las enzimas utilizadas para la disociación, incluidas la tripsina empleada para disociar células madre embrionarias de ratón y la colagenasa tipo IV y proteasa E, empleadas para la disociación de células madre embrionarias humanas (Wang y col 2005). Todas estas enzimas intervienen fuertemente en la capacidad de autorrenovación y causan diferenciación espontánea. Sin embargo, recientemente Roach y col (2006) reportaron la generación de células madre embrionarias bovinas que pudieron ser disociadas utilizando una baja concentración de tripsina 0,05%/EDTA. Aunque el método necesita ser optimizado en cada caso, estos investigadores han desarrollado líneas de células madre embrionarias bovinas con morfología similar a las establecidas para células madre embrionarias humanas y de ratón, así como marcadores de expresión idénticos a los que se expresan en embriones bovinos en estado de blastocistos (Roach y col 2006).

Diferenciación de las células madre embrionarias

El gran objetivo de la tecnología de las células madre embrionarias consiste en dirigir los cultivos de células in- diferenciadas hacia la formación de tejidos y órganos para terapias de reemplazo celular (Rippon y Bishop 2004). Las células utilizadas para estos propósitos terapéuticos deben ser seleccionadas por su estabilidad genética y normalidad, antes de iniciar la aplicación terapéutica en humanos. De esta forma, el principal desafío para la aplicación futura de las terapias de sustitución celular es el control sobre la diferenciación de estas células hacia tejidos específicos. Es por tanto necesario desarrollar procedimientos que conduzcan eficazmente a la diferenciación de las células madre embrionarias hacia los tipos específicos de células que se requieran en cada caso. La diferenciación in vitro de estas células se realiza removiendo del medio de cultivo los factores que las mantienen indiferenciadas y aplicando los estímulos apropiados necesarios para su diferenciación hacia las tres líneas germinales embrionarias (figura 2) (Keller 1995, Smith 2001). Cuando estas células son cultivadas en suspensión, en ausencia de factores antidiferenciación, forman agregados celulares tridimensionales llamados cuerpos embrionarios (EB, del inglés Embryo Bodies) (figura 2), los que luego de 2-4 días en cultivo forman el endodermo, dando lugar a un cuerpo embrionario simple, el cual se diferencia al cuarto día generando una estructura más compleja con epitelio columnar y membrana basal (Leahy y col 1999). En esta etapa, los cuerpos embrionarios son llamados cuerpos embrionarios quísticos (Evans y Kaufman 1981, Keller y col 1993, Ng y col 2005). La continuación en cultivo y la exposición a los estímulos y/o agentes químicos adecuados pueden inducir la diferenciación de estos cuerpos embrionarios hacia un linaje específico, por ejemplo ácido retinoico para la diferenciación a células neuronales (Ezekiel y col 2007), aFGF (del inglés acidic Fibroblast Growth Factor) y HGF (del inglés Hepatocyte Growth Factor) para diferenciación en células hepáticas (Hu y col 2003), TSH (del inglés thyroid Stimulating Hormone) para la diferenciación en adipocitos (Lu y Lin 2008) y en conjunto bFGF, IGF-1 (del inglés Insulin-like Growth Factor-1) y nicotinamida para su diferenciación en células semejantes a los islotes del páncreas, entre otros (Liu y col 2005, Liersch y col 2006).

Para determinar el potencial de diferenciación in vivo, las células madre embrionarias de origen animal se agregan a embriones de ocho células o a embriones en la etapa de blastocisto para originar una quimera en la que posteriormente es necesario establecer la contribución de estas células en la formación de la masa celular interna y del trofoectodermo (Saito y col 2003) y en al menos un porcentaje no inferior al 10% en la formación de algún tejido en los animales nacidos (Stice y col 1996, Cibelli y col 1998). Como por razones éticas esta evaluación no se puede realizar en humanos, en las células madre embrionarias humanas y también en las de algunos animales, la pluripotencia in vivo se confirma por la formación de teratomas, luego de su inyección en ratones con inmunodeficiencia combinada (Stojkovic y col 2004).

Marcadores de pluripotencia asociados a las células madre embrionarias

Los análisis moleculares han revelado que la citoquina LIF actúa a través de la activación del receptor de membrana gp130 del factor de transcripción STAT3 (del inglés Signal transducer and Activator of transcription 3) (Niwa y col 1998, Matsuda y col 1999), mientras que el efecto de BMP4 estaría mediado por la activación del factor de transcripción SMAD (del inglés Small Mothers Against Decapentaplegic) y la subsiguiente inducción del factor inhibitorio de la diferenciación (Id, del inglés Inhibitory Differentiation Factor) de tipo bHLH (del inglés basic Helix-Loop-Helix). Además de STAT3 e Id, otros dos factores de transcripción que han mostrado tener roles fundamentales en la mantención del estado indiferenciado de las células madre embrionarias son Oct-4 (del inglés octamer transcription Factor-4) (Niwa y col 2000) y Nanog (Chambers y col 2003, Mitsui y col 2003).

Oct-4 es esencial para el desarrollo inicial de la pluripotencialidad en el macizo celular interno de cigotos de ratón y para mantener la pluripotencialidad de las células madre embrionarias, respectivamente. No obstante, análisis cuantitativos revelaron que los niveles altos de expresión de este factor inducen la diferenciación de las células madre embrionarias de ratón hacia líneas del endodermo y mesodermo, mientras que niveles bajos de expresión inducen pérdida de la pluripotencialidad y desdiferenciación hacia células del trofoectodermo (Niwa y col 2000). Por esta razón, se ha postulado a este factor de transcripción como “regulador maestro de la pluripotencialidad”, ejerciendo su efecto mediante la regulación de la expresión de al menos siete genes necesarios para la diferenciación (Pesce y col 1998). En otras especies como cerdos, bovinos y humanos también se ha confirmado la presencia de este factor en el macizo celular interno y en el trofoectodermo (van Eijk y col 1999, Kirchhof y col 2000, Saito y col 2003), llevando a especular una función similar a la de las células madre embrionarias de ratón (Mitalipova y col 2003, Reubinoff y col 2000). De igual forma, se ha identificado a Nanog como otro factor maestro regulador de la pluripotencialidad de las células madre embrionarias (Chambers y col 2003, Mitsui y col 2003). La expresión de este factor se ha observado tanto en células madre embrionarias de ratón como humanas, estando ausente en las células diferenciadas. Sin embargo, Nanog es capaz de mantener la autorrenovación de células madre embrionarias de ratón independientemente de la vía STAT3/LIF asociada al factor de transcripción Oct-4.

Las células madre embrionarias de ratón exhiben además actividad fosfatasa alcalina (Resnick y col 1992) y telomerasa (Armstrong y col 2000), al igual que muchas de las líneas de células madre embrionarias humanas (Smith 2001, Carpenter y col 2003, Ginis y col 2004). No obstante, en células madre embrionarias bovinas esta actividad es muy variable (Talbot y col 1995, Stice y col 1996, Strelchenko 1996, Cibelli y col 1998). Adicionalmente existen antígenos característicos asociados a la pluripotencialidad de las células madre embrionarias denominados marcadores de indiferenciación y/o pluripotencia. Los antígenos embrionarios específicos de SSEA-1 (del inglés Stage Specific Embryonic Antigen-1) y SSEA-3 se observan en células madre embrionarias de ratón, mientras que las células madre embrionarias humanas expresan SSEA-3 y SSEA-4 (Carpenter y col 2003). En el caso de las células madre embrionarias bovinas, estudios inmunohistoquímicos revelaron la expresión de SSEA-1 (Saito y col 2003), pero se han obtenido resultados contradictorios con respecto a la expresión de SSEA-3 y SSEA-4 (Mitalipova y col 2001, Saito y col 2003).

Transformación genética de las células madre embrionarias mediante recombinación homóloga dirigida (gene targeting)

En la década de los ochenta se estableció el gran valor de las células madre embrionarias como herramienta para experimentos de mutagénesis dirigida, al reemplazar o eliminar (knock-out) selectivamente un determinado gen en el genoma de un animal. Para llevar esto a cabo, se realiza la modificación genética del gen seleccionado en una copia clonada del mismo, la cual se transfiriere posteriormente al genoma de las células mediante recombinación homóloga con una secuencia de ADN similar en el cromosoma. Si estas células se inyectan en embriones de ratón en desarrollo (blastocistos) pueden colonizar el embrión y generar descendencia transgénica, contribuyendo eficientemente hacia la línea germinal de las quimeras resultantes, las que luego de su retrocruzamiento permiten la generación de una línea pura de animales homocigotos para la modificación genética deseada (Gossler y col 1986, Robertson y col 1986).

Los trabajos pioneros de recombinación homóloga en células madre embrionarias de ratón sentaron las bases del primer modelo animal para el síndrome de Lesch-Nyhan, un raro desorden neurológico caracterizado por la deficiencia de la enzima hipoxantina fosforibosil transferasa (HPRT, del inglés Hypoxanthine-Guanine Phosphoribosyl transferase) (Doetschman y col 1987, Thomas y Capecchi 1987). De esta forma, esta técnica entregó a los investigadores una poderosa herramienta para generar animales transgénicos con mutaciones precisas en su genoma, contándose hasta la fecha con más de 5.000 genes inactivados en el ratón. Estos modelos están siendo utilizados para el estudio de diversas enfermedades genéticas y para comprender procesos biológicos incluyéndose para el análisis de la función y regulación de genes endógenos (Houdebine 2002). Sin embargo, a pesar de su gran utilidad, estos modelos knock-out tienen pocas posibilidades reales para desarrollar tratamientos clínicos o para estudiar los efectos a largo plazo en la salud como resultado de estas modificaciones. La principal restricción del modelamiento de patologías humanas en el ratón están dadas por sus diferencias fisiológicas y reproductivas, incluyendo el número de progenie, su menor tamaño y corta vida, lo que ha motivado por años la generación de animales domésticos que puedan constituirse en mejores modelos para ser utilizados para estos propósitos.

A pesar de los esfuerzos, las aplicaciones de esta tecnología en especies domésticas se han visto restringidas debido a que aún no se ha demostrado que las células madre embrionarias generadas en estas especies contribuyan a la línea germinal (Niemann y Reichelt 1993, Cibelli y col 1998, Iwasaki y col 2000, Wang y Zhou 2003). No obstante este desalentador escenario, actualmente la tecnología de transferencia nuclear de células somáticas está abriendo nuevas oportunidades. Mediante el nacimiento de la oveja Dolly (Wilmut y col 1997), esta tecnología demostró no sólo la capacidad de utilizar células somáticas para generar un individuo adulto, sino además la factibilidad de manipular genéticamente estas células para generar animales que además de ser clonados son también transgénicos (Schnieke y col 1998). Este importante hito científico pavimentó el camino para los trabajos pioneros de recombinación homóloga en animales domésticos, permitiendo de esta forma la generación de los primeros modelos de animales domésticos con mutaciones definidas en su genoma. Uno de estos modelos busca prevenir el rechazo hiperagudo que se produce en el trasplante de órganos de cerdo a humanos, que se cree estaría dado por el epítope -1,3-galactosa que está presente en las células de cerdo pero no en las células humanas, por lo que su eliminación podría aplacar algunos de los aspectos del estímulo de rechazo (Wang y Zhou 2003). Recientemente se ha logrado la eliminación de este gen en células somáticas, las que fueron posteriormente utilizadas como donantes de núcleo en experimentos de transferencia nuclear, generándose los primeros cerdos knock-out para esta mutación, estando a la espera las investigaciones de los tejidos y órganos de estos animales en otros modelos no humanos, que sin duda entregarán valiosa información respecto al mecanismo de rechazo hiperagudo, acercando las posibilidades para la utilización de estos órganos en trasplantes humanos (Dai y col 2002, Phelps y col 2003, Sharma y col 2003).

La encefalopatía espongiforme bovina (EEB), más conocida como enfermedad de las vacas locas, es una enfermedad neurodegenerativa causada por proteínas resistentes a proteasas denominadas priones (PrP, del inglés Prion Protein) (van Keulen y col 2008). Debido a que las ovejas y los bovinos poseen genes funcionales de los priones y son utilizados para generar productos biomédicos, tales como gelatina, colágeno y recientemente proteínas humanas en biorreactores transgénicos, se hace necesario disponer de animales resistentes a los priones. Los primeros modelos de ratones generados donde se eliminó una copia del gen del prion (PrP +/-) no evidenciaron anormalidades en su conducta, mientras que los homocigotos nulos (PrP -/-) no desarrollaron las características clínicas y patológicas clásicas del scrapie luego de su inoculación con priones de ratón (Bueler y col 1994). Estos hallazgos sugieren que la eliminación de este gen en ovejas y bovinos podría permitir la generación de modelos animales resistentes a la EEB o al scrapie. Los primeros experimentos tendientes a demostrar esta hipótesis corresponden a los trabajos recientes de Denning y col (2001) quienes generaron ovejas heterocigotas para este gen, estando a la espera la generación de líneas de animales homocigotos nulos, antes de que se pueda evaluar la sobrevivencia y resistencia de estos animales a la enfermedad.

Aplicaciones de las células madre embrionarias en biomedicina

Desarrollo de nuevas drogas

Se ha sugerido que las células madre embrionarias pueden tener su aplicación en el descubrimiento y desarrollo de nuevas drogas con potencial farmacéutico (figura 3). En efecto, algunos tipos celulares como cardiomiocitos y hepatocitos generados desde células madre embrionarias humanas podrían proporcionar una población ideal de células para evaluar con mayor exactitud la efectividad de un determinado fármaco o su toxicidad (Keller 2005). Este sistema proporcionaría ventajas adicionales ya que las células humanas pueden revelar la toxicidad de ciertas drogas que no necesariamente se detectan en los análisis convencionales, como en los ensayos desarrollados con líneas celulares de ratón o los ensayos llevados a cabo in vivo en animales.

Terapia de reemplazo celular

La aplicación de las células madre embrionarias que ha recibido mayor atención en los últimos años es la terapia de reemplazo celular o medicina regenerativa (figura 3), que permitiría el tratamiento de una amplia variedad de enfermedades debilitantes, tales como diabetes tipo I, enfermedades cardiovasculares, enfermedad de Parkinson y enfermedades de las células sanguíneas (Doss y col 2004). En este caso, lo que se busca es reemplazar células dañadas por células funcionales que restituyan la función normal de los tejidos u órganos de forma más eficiente que a través de terapias convencionales como son los trasplantes, las terapias farmacológicas y/o los tratamientos con proteínas recombinantes. Sin embargo, hasta la fecha el éxito de estas terapias es limitado, existiendo varias interrogantes que aún necesitan ser resueltas. Una de ellas es el número de células que deben ser trasplantadas y su estado de diferenciación. Además, en el trasplante con células madre embrionarias existe el riesgo de contaminación con células madre embrionarias residuales no diferenciadas, las cuales se sabe pueden desarrollar teratomas cuando son trasplantadas (Evans y Kaufman 1981, Thomson y col 1998). Esto ha motivado a que actualmente se estén desarrollando técnicas que permitan la purificación de células con un linaje determinado para ser utilizadas con seguridad en los trasplantes (Li y col 1998, Doss y col 2004).

Otro obstáculo a sobreponer es la compatibilidad donante/receptor y el rechazo al trasplante, para lo cual se ha sugerido establecer un banco de muchas líneas de células madre embrionarias que incluirían una proporción significativa de los tipos de histocompatibilidad en la población (Keller 2005). Actualmente existen muchas investigaciones enfocadas a descubrir células progenitoras que sirvan como banco de células para usos terapéuticos, evaluándose varias estrategias que incluyen terapias celulares derivadas de células autólogas, de líneas celulares establecidas desde una variedad de células madre incluyendo la médula ósea, cordón umbilical, células madre embrionarias, así como células de tejidos y órganos de animales genéticamente modificados (Asahara y col 2000, Fodor 2003).

Clonación terapéutica

Para sobreponer el problema habitual del rechazo del injerto por el sistema inmunológico del receptor se han desarrollado numerosas estrategias, la más reciente y conflictiva es quizás la clonación terapéutica, la cual involucra la obtención de células madre embrionarias isogénicas desde embriones clonados, las que pueden ser diferenciadas específicamente en células regenerativas para pacientes que requieren terapia de trasplante celular (Han y col 2007). En la clonación terapéutica los núcleos de células somáticas de un paciente son fusionados con ovocitos enucleados, cultivándolos in vitro hasta la etapa de blastocistos y derivando de la masa celular interna líneas de células madre embrionarias isogénicas humanas (figura 3). Sin embargo, las limitaciones de este procedimiento están dadas por la prohibición que existe en muchos países para generar embriones humanos clonados y por la escasez de ovocitos humanos para estos propósitos (Mombaerts 2003).

El apoyo que existe actualmente para generar y utilizar líneas de células madre embrionarias humanas varía entre los diferentes países. En Inglaterra, por ejemplo, la HFEA (The Human Fertilisation and Embryology Authority) aprobó la generación de líneas de células madre embrionarias humanas de embriones sobrantes de procedimientos de fecundación in vitro, decisión que también han impulsado España y Suiza. En nuestro país, en cambio, se ha promulgado recientemente la Ley 20.120 (Diario Oficial 22/09/06) en la cual se prohíbe la clonación de seres humanos para cualquier fin y la destrucción de embriones para obtener las células madre embrionarias. En Corea del Sur y otros países asiáticos se aprobó la utilización de embriones humanos clonados para generar líneas de células madre embrionarias (Bavister y col 2005), situación que generó gran conmoción en la comunidad científica mundial, cuando en el año 2004 Woo-Suk Hwang y sus colaboradores anunciaron la obtención de 11 líneas de células madre embrionarias humanas, que provenían de embriones clonados de pacientes con diversas enfermedades inmunológicas congénitas, tales como diabetes tipo I y lesiones en la médula espinal (Hwang y col 2004). Sin embargo, el mismo investigador declaró posteriormente que su trabajo publicado en la revista Science había sido un engaño, aunque su laboratorio poseía la tecnología y capacidades para llegar a hacerlo.

Una forma de evitar la utilización de embriones clonados son los resultados promisorios que revelan que ambos gametos, ovocitos y espermatozoides, pueden potencialmente derivarse desde células madre embrionarias crecidas in vitro (Hubner y col 2003, Toyooka y col 2003, Geijsen y col 2004). Otra estrategia para generar líneas de células madre embrionarias isogénicas consiste en la fusión de células somáticas con células madre embrionarias, método que ha permitido generar líneas celulares híbridas con cierta conservación de la pluripotencialidad (Tada y col 2001). Más recientemente, investigadores del Instituto Advanced Cell Technology de EE.UU.3 describieron un método alter­ nativo para establecer células madre embrionarias usando una técnica de biopsia de células embrionarias, similar a la utilizada para diagnóstico genético preimplantacional, que no interfiere con el potencial desarrollo del embrión. En este caso, blastómeras individuales fueron extraídas desde un embrión de ratón y/o humano a partir de las cuales se desarrollaron células madre embrionarias que se mantuvieron en cultivo por más de ocho meses, mostrando un cariotipo normal y los marcadores clásicos de pluripotencia.